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生科院华子春课题组发现脂代谢调控的一种新机理

FADD是死亡受体介导的细胞凋亡途径的一个重要信号接头蛋白,是一个公认的经典凋亡蛋白分子。多年来,南京大学生命科学院华子春教授课题组独辟蹊径、努力探索和挖掘国际上这一公认的细胞死亡蛋白在细胞凋亡以外的新生物学功能。最近,华子春课题组经过长期、艰苦的潜心研究和摸索,围绕FADD的新生物学功能取得了三项研究进展。

9 月 13 日,国际学术期刊《自然 –
通讯》在线发表了中国科学院营养与健康研究所章海兵研究组的最新研究成果
“Ubiquitination of RIPK1 suppresses programmed cell death by regulating
RIPK1 kinase activation during embryogenesis”。该研究揭示了重要激酶蛋白
RIPK1 通过 K376
位点的泛素化修饰,调控细胞生存与死亡命运转换的关键分子机制,为相关疾病的治疗提供了新的思路。细胞死亡是多细胞生物体维持自身稳态与正常发育的基本生命活动,人类多数疾病从根本上说归因于细胞死亡异常。RIPK1
蛋白是调控细胞凋亡、细胞程序性坏死以及炎症信号通路中的关键分子,参与胚胎发育、造血系统发育以及免疫稳态维持等多种重要生物学过程,最近有报道发现
RIPK1 基因突变的病人同时表现自身免疫缺陷及自身炎症性疾病,提示 RIPK1
在人体免疫调控中具有关键作用,而且靶向 RIPK1
的小分子药物治疗渐冻症、风湿性关节炎以及结肠炎等疾病也在临床试验阶段。分子机理研究显示,RIPK1
一方面通过参与介导 NF-kB 及 MAPK
信号通路促进细胞存活及炎症反应,另一方面 RIPK1 可以通过与 FADD、Caspase8
等分子互作介导细胞凋亡,而当凋亡通路被抑制时,RIPK1 可以通过与 RIPK3
结合形成坏死小体,激活下游 MLKL 诱导细胞程序性坏死的发生。而目前对 RIPK1
在不同应激条件下如何通过转换不同的信号通路而决定细胞存活或死亡,这个关键的生死转换的分子机制仍不清楚。

导读:
姜黄素是姜黄根茎提取活性成分,具有抗炎、抗凝、抗氧化,降血脂和抗肿瘤特性。近年来姜黄素的抗肿瘤作用逐渐成为研究热点之一。姜黄素可抑制在肿瘤的发生和发展中起着关键作用的细胞核转录因子-κB(NF-κB)和STAT蛋白抑制因子3信号通路。同时,对蛋白转录因子SP-1和管家基因表达的抑制作用可防止肿瘤的形成,迁移和侵袭。最近研究还发现,内质网应激和自噬在细胞凋亡过程中发挥作用,而抑制自噬可增加姜黄素及类似物介导的内质网应激,从而进一步诱导细胞凋亡。欢迎引用本文:赵经文
. 姜黄素调控抗肿瘤相关细胞转录因子及信号转导通路的研究进展[J].
天津中医药大学学报, 2016, 35: 351-355.ZHAO Jing-wen . Advances on the
research of curcumin on the regulation of transcription factors and
signal pathways for anti tumor treatment[J]. Journal of Tianjin
University of Traditional Chinese Medidine, 2016, 35:
351-355.姜黄素调控抗肿瘤相关细胞转录因子及信号转导通路的研究进展赵经文姜黄素是从姜科植物Curcuma
longaplant的根茎提取的黄色物质,属于多酚家族,是姜黄的活性成分之一。姜黄中主要含有3种成分,姜黄素、去甲氧基姜黄素和二去甲氧基姜黄素,其中姜黄素约占2%~5%,被公认为是姜黄中的最有效和最丰富的成分,具有抗炎、抗凝、抗氧化、调节糖脂代谢和抗肿瘤等特性。近年来,姜黄素的抗肿瘤作用逐渐引起关注,成为天然药物抗肿瘤研究的热点之一。姜黄素可引起多种肿瘤细胞的凋亡,而不损伤正常组织来源的原代细胞。本文将主要介绍姜黄素在抑制血管生成与诱导肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤过程中,所调控的相关转录因子以及相关通路的功能与机制。1
调控转录因子的抗肿瘤机制在肿瘤发生发展过程中,原癌基因激活与抑癌基因失活发挥着重要的调节作用。已有研究表明,姜黄素通过抑制部分原癌基因的表达,从而抑制细胞增殖,造成细胞周期停滞,其机制与相互作用的转录因子有密切的关系。例如,姜黄素可通过抑制细胞核转录因子-κB(NF-κB)和STAT-3信号通路,在抑制肿瘤发生和发展中发挥关键作用。还可与p53,Notch-1,激活子蛋白-1,早期生长反应基因,β-连环蛋白(β-catenin),低氧诱导因子-1,过氧化物酶体增殖物激活受体-γα(PPAR-γα)等相互作用,从而诱导细胞凋亡。在cl-5异种移植肿瘤模型中,姜黄素也被证实可引起表皮生长因子受体、丝氨酸/苏氨酸激酶、肝细胞生长因子及其受体、细胞周期蛋白D1(Cyclin
D1)下调。此外,它还可通过上调抑癌基因HLJ1的表达,抑制肺癌细胞的侵袭和转移。1.1
NF-κB转录因子及相关信号通路NF-κB几乎存在于各种细胞中。其家族有5个成员:
c-Rel、p65、RelB、p50/p105(NF-κB1)和p52/p100(NF-κB2)。在转录水平上NF-κB可调控多种基因的表达,从而调控细胞因子、趋化因子、细胞间黏附分子、生长因子、免疫受体等,并参与肿瘤发生、免疫应答、细胞凋亡等多种过程。在肿瘤细胞中,NF-κB能够被多种刺激因子如肿瘤坏死因子、白介素-1、细胞脂多糖等激活。体内和体外研究证实,NF-κB不适当的激活和表达会激活各种致癌因子和炎性生长因子,从而导致放化疗治疗诱导的肿瘤细胞凋亡过程被抑制。随后的研究证实,姜黄素能够抑制转录因子NF-κB的活化,选择性阻断IκBα磷酸化和降解,导致NF-κB
活化的废止和下调NF-κB依赖的调节炎症因子环氧化酶-2
的表达。有研究结果表明,姜黄素可呈剂量依赖性的抑制MCF-7细胞增殖,并通过抑制NF-κB的活化下调尿激酶型纤溶酶原激活物的表达,抑制MCF-7细胞的黏附和侵袭。Mishra等研究者通过检测姜黄素对口腔癌细胞的作用,发现姜黄素可以通过下调细胞转录因子AP-1及NF-κB的水平来降低感染的口腔癌细胞中人乳头状瘤的表达。Marquardt等发现姜黄素介导的细胞凋亡与NF-κB受抑制程度直接相关,并且姜黄素处理后肿瘤干细胞标记表达下降,以及肿瘤形成受到抑制,从而导致肿瘤干细胞出现特异性缺失。研究结果还发现用I/II类组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatine
A处理姜黄素耐受性细胞会促进此类细胞对姜黄素的敏感性。从而可通过NF-κB和HDAC两条途径的联合抑制来治疗预后不良的肝癌病人。Bortel等通过研究姜黄素与顺铂对小儿恶性肝肿瘤细胞株HC-AFW1
与HepG2的影响,发现细胞内NF-κB与β-catenin均受到抑制,Cyclin
D1明显减少。并进一步在小鼠异种移植模型上通过口服姜黄素和顺铂进行治疗,结果显示血清α-甲胎蛋白显著减少,肿瘤增殖明显被抑制。1.2
STAT3转录因子及相关信号通路STAT蛋白抑制因子3是转录因子STAT家族的成员,在受到生长因子如表皮细胞生长因子、血小板衍生因子、集落刺激因子,细胞因子干扰素、白介素,G蛋白磷酸化途径血管紧张素等细胞外信号刺激时,通过激酶酪氨酸磷酸化而被激活。研究表明,STAT3是促进炎症向肿瘤转化的主要因子,还可使肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性。STAT3分子可作用于多种途径,如细胞增殖和凋亡,肿瘤血管生成和肿瘤免疫逃避等。STAT3的异常激活可通过表达抗凋亡蛋白bcl-XL和cyclinD1,抑制肿瘤细胞凋亡,促进肿瘤细胞增殖,侵袭和血管生成。STAT3在多种肿瘤细胞中都会过度激活,包括乳腺癌、前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病、脑肿瘤、结肠癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、鼻咽癌、胰腺癌。Zhang等发现姜黄素可诱导具有高潜力的侵袭和转移的恶性黑色素瘤A375细胞发生明显凋亡,细胞生长抑制呈时间、浓度依赖性,其抑制作用与JAK-2/STAT-3信号通路有关。同时磷酸化蛋白酪氨酸激酶-2与STAT-3磷酸化水平降低,Bcl-2蛋白表达下降。Saydmohammed等研究发现,在卵巢癌和子宫内膜癌细胞中,姜黄素能通过下调活化STAT3的表达,抑制IL-6诱导的STAT3的磷酸化,进而抑制JAK-STAT信号通路。Hu等发现,用1或10μmol/L姜黄素处理喉鳞状癌细胞Hep-2细胞48
h后,JAK-2,p-STAT3、MMP-2的表达均明显降低。同时通过抑制JAK-2的激活和抑制p-STAT3的表达,抑制Hep-2细胞的生长,增殖,迁移和血管形成。AG490是JAK2抑制剂,能够抑制STAT-3磷酸化,作用却弱于姜黄素。Fetoni等对姜黄素与顺铂联合治疗头颈部鳞状细胞癌的效果进行了评估,发现它们可任意通过调节STAT-3和NF-E2
p45相关因子2抑制肿瘤发展从生存到增殖各个阶段,并在下调顺铂的耐药性同时降低了顺铂的耳毒性不良反应。Chung等在研究通过STAT-3促进乳腺癌肿瘤干细胞性状的分子机制的发现,联合姜黄素和儿茶素治疗可抑制STAT-3磷酸化,阻止其进入细胞核,使STAT-3与NF-κB相互作用明显降低,从而降低肿瘤干细胞样分化群CD44阳性群,使其介导的肿瘤侵袭与迁移水平下降。Yang等对姜黄素类似物EF24的研究中发现EF24在DU145前列腺癌细胞和小鼠B16黑素瘤细胞中可抑制JAK-STAT信号通路。EF24可明显抑制免疫抑制小鼠前列腺癌移植瘤的生长,提高DU145肿瘤组织的PTEN、PDCD4等miR-21的靶基因的表达,并抑制细胞增殖标记物cyclin
D1和Ki67的表达。1.3
SP-1转录因子及相关信号通路特异性蛋白转录因子SP-1是一种体内广泛表达的转录因子。在乳腺癌、胃癌、胰腺癌和甲状腺肿瘤细胞中SP-1表达水平明显高于周围正常组织。它可与序列特异的DNA结合,并与核因子、蛋白质相互作用。SP-1通过氨基端的特异激活区和抑制区与共激活或共抑制因子相互作用来调节基因的转录,从而激活多种生物学功能,包括调控细胞周期和癌变。SP-1对许多管家基因具有重要的调控作用,如血管内皮生长因子、尿激酶型纤溶酶原激活物、尿激酶型纤溶酶原激活物受体和上皮生长因子受体,从而参与细胞分化,肿瘤血管生成和转移。因此,抑制SP-1和其管家基因的过表达能抑制肿瘤细胞的形成迁移和侵袭。最近的研究表明,姜黄素可通过抑制SP1激活和其下游基因,包括adem10、CALM、EphB2、HDAC4和SEPP1抑制结肠癌细胞,并呈浓度依赖性方式。Lou等发现,姜黄素可降低SP-1在非小细胞肺癌的DNA结合活性。
Chadalapaka 等发现10~25
mmol/L的姜黄素可抑制膀胱癌细胞系KU7和253JB.V的增殖,诱导细胞凋亡,并下调
VEGF与血管内皮细胞生长因子受体1
的表达。由于表达Survivin、VEGF、VEGFR1均依赖于SP转录因子,研究进一步还发现姜黄素可使SP1、SP3和SP4的下调。1.4
细胞黏附因子黏着斑激酶是一种非受体蛋白酪氨酸激酶,可调控细胞与细胞间以及细胞与细胞外基质的黏附,是整合素介导的细胞黏附与迁移信号途径的媒介。FAK激活后可激活一系列下游信号分子,如PIsK、Grb2、Shc及STAT等,来参与细胞的分化、增生、伸展与迁移。在肿瘤发生发展中,FAK在信号转导通路的调节中起着关键作用。研究显示,当内皮细胞中的FAK失活时,肿瘤细胞虽然仍能黏附在内皮细胞层,却无法穿越内皮屏障到达血液或者淋巴管。因此高表达的FAK可能增加肿肿瘤细胞的侵袭转移能力,是肿瘤复发的因素之一。已有实验证实,姜黄素能通过抑制其磷酸化位点抑制FAK的活性,可呈剂量依赖性诱导细胞外基质成分的表达,如胶原Ⅰ、胶原Ⅲ
、Ⅳ型胶原、层黏连蛋白、胶原蛋白IX、纤维连接蛋白,提高内皮细胞的黏附能力,从而防止肿瘤细胞侵袭和迁移,这可能是姜黄素抗侵袭作用的潜在机制。姜黄素能够呈剂量依赖性的降低结肠癌细胞的CD24蛋白表达。同时上调E-cadherin的表达,抑制上皮-间质细胞转化。结肠癌细胞中,姜黄素能通过下调SP-1,FAK表达,CD24和升高E-cadherin的表达来发挥抗肿瘤细胞转移的功能。研究表明,姜黄素能通过抑制FAK蛋白的表达和激活Caspase途径抑制胶质瘤U251细胞的增殖并进一步诱导U251细胞凋亡。2
内质网应激途径与自噬途径的抗肿瘤机制细胞凋亡的通路主要有线粒体损伤途径、死亡受体的活化,以及新发现的内质网应激启动的凋亡途径。内质网是真核细胞蛋白质合成和成熟的重要细胞场所。细胞受到内外因素刺激时,可能影响内质网形态和功能的平衡,干扰蛋白质折叠,从而导致未折叠或错误折叠的蛋白质累积在内质网,造成内质网应激,引发未折叠蛋白质反应。而肿瘤组织处于缺氧、营养成分缺乏的微环境下会激活ERS和UPR,从而适应体内环境,保证细胞存活,并使肿瘤对治疗抵抗。在很多肿瘤中可检测到UPR下游信号的激活。自噬是细胞在受到外界变化(如营养成分缺乏、缺血缺氧、生长因子的浓度变化等)或细胞内的变化(如代谢压力、细胞器衰老或破损、蛋白质折叠错误或聚集等),将细胞内破损细胞器或错误的蛋白质运输到溶酶体进行消化降解的过程,从而保证细胞的存活。自噬在真核生物中进化过程中高度保守的一种蛋白消化降解途径。正常条件下,自噬具有保持细胞大小和稳态的功能;在应激条件下,自噬可以避免细胞处于不利环境,发挥抑制肿瘤恶性转化和发生;然而肿瘤生长的早期阶段,肿瘤的血管形成和营养供应相对不足,自噬会增强从而帮助细胞适应恶劣的肿瘤微环境并促进肿瘤的生长发展。内质网应激诱导的未折叠蛋白应答和细胞自噬已被证实参与调节肿瘤细胞。不同的抗肿瘤疗法可能激活肿瘤细胞中相关信号通路,促进或抵抗肿瘤细胞的凋亡。Qu等研究显示在卵巢上皮肿瘤细胞和肝癌细胞中,姜黄素类似物B19可呈剂量依赖性诱导HO8910细胞凋亡,并抑制早期自噬,并可增加内质网应激诱导的细胞凋亡。Zhou等发现EF25-2显著抑制肝癌细胞株HepG2增殖。LC3-II定位于前自噬体和自噬体,是自噬体的特异性标志,在溶酶体中与自噬体所运输的货物一同被降解。因此可以通过测量LC3-II的水平改变情况分析自噬途径。研究发现5
μmol/L EF25-2下,自噬途径被激活并发生自噬性降解,但在10和20
μmol/L浓度时,自噬受到抑制。此外,姜黄素还可通过直接抑制蛋白酶体活性增加E3泛素连接酶的转录。赵小军等在宫颈癌细胞研究中,姜黄素治疗组的内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78升高,说明姜黄素可诱发肿瘤细胞内内质网应激的发生,同样还可检测到C/EBP同源蛋白质mRNA及蛋白表达显著升高,说明内质网应激剧烈程度产生的信号,足以活化下游的ATF-4/CHOP信号通路,因此内质网应激途径是姜黄素诱导宫颈癌细胞凋亡的重要机制之一。3
展望肿瘤疾病严重的威胁着人类健康,因此抗肿瘤作用及机制的研究具有十分重要的理论意义和实用价值。现在药用研究突破了传统中医上姜黄素的破气、行血、止痛的传统功效,发现其实一种有广泛应用前景的抗肿瘤药物。姜黄素及其类似物已被证明具有一系列的肿瘤细胞系不同的抗肿瘤特性,如胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌,甚至黑色素瘤。由于具有分子量小,毒副作用小,抗肿瘤谱较广的优点,表现出巨大的潜力。由于姜黄物是一种脂溶性茶多酚,首过效应明显,水溶性差,其生物利用度低。因此有很多关于合成姜黄素类似物的制备开发和药理评价研究,这些化合物有更好的稳定性和体内药代学指标,在不同模型、不同的肿瘤细胞株上有良好的治疗潜力。另一方面,将姜黄物制备成纳米制剂可增强药物的水溶性,提高药物传递水平,有效的改变姜黄素的生物利用度,提高药物在肿瘤部位的积累,同时延长药物释放,使其具有更高程度的通用性,有更好的临床应用前景。

该课题组青年教师庄红芹在国际上首次发现FADD具有调控脂代谢的新功能,其分子机制是通过FADD调控细胞内脂肪代谢途径中关键转录因子PPARα的转录活性来实现的(EMBO
Mol Med. 2016 Aug 1;
8:895-918)。研究发现FADD磷酸化或FADD脂肪组织特异性缺失均可以逆转高脂饮食喂养或者瘦素基因缺失引起的小鼠肥胖表型,研究成果可能对肥胖症或者脂代谢综合症的临床治疗具有指导意义。该结果于2016年8月在EMBO
Mol Med正式刊出。

章海兵课题组的研究人员发现 RIPK1 的一个主要的泛素化位点 Lys376
的泛素化修饰是决定细胞命运的关键。Lys376 是 RIPK1
蛋白上的重要泛素连接位点,可以通过连接 K63 泛素链招募下游 IKK
复合体,从而激活 NF-kB 信号通路。利用 CRISPR-Cas9
基因编辑系统,研究人员构建了 RIPK1 K376R
位点突变的小鼠,并意外地发现纯合突变的小鼠在胚胎发育至 12.5
天时死亡。研究人员进一步发现,从突变小鼠胚胎分离的成纤维细胞对于 TNF-a
介导的细胞凋亡和细胞坏死表现出较野生型细胞更强的敏感性,而 RIPK1
的激酶抑制剂 Necrostatin-1
能够有效抑制突变细胞的过度死亡。因此,该突变引起的小鼠胚胎致死可能是过度激活了
RIP1
激酶活性依赖的细胞凋亡和细胞坏死。为了在体内验证这一推测,研究人员对突变小鼠进行了药物干预,发现
Necstatin-1
能够有效延迟小鼠的胚胎期死亡。而在突变小鼠的背景下同时敲除介导细胞凋亡的蛋白
FADD 和介导细胞坏死的蛋白 RIPK3 或 MLKL
能够使突变小鼠存活至成年。而当小鼠仅携带一半剂量的突变基因时,该小鼠也能够存活至成年。这些结果说明,在胚胎正常发育过程中,Lys376
介导的 RIPK1 泛素化能够 “关闭”RIPK1
的激酶活性,从而抑制细胞异常的细胞凋亡和程序性坏死,保证胚胎的正常发育。此外,研究人员发现在突变小鼠的基础上敲除
TNFR1
也能够阻止突变小鼠的胚胎致死,但是该双突变小鼠在出生后两周内会发生严重的系统性炎症。研究人员意外地发现这种严重的系统性炎症是依赖于
RIPK3 的,敲除 RIPK3
可以显著抑制这种系统性炎症疾病的发生。这些结果说明,在小鼠出生后,Lys376
介导的 RIPK1 泛素化能够抑制 RIPK3
依赖的系统性炎症。综上所述,该研究通过对 RIPK1 Lys376
位点体内功能的研究,阐明了这一重要位点通过调控 RIPK1
的激活介导的细胞死亡及炎症信号通路,从而调控胚胎发育和炎症性疾病的分子机制,为今后探究
RIPK1
的泛素化修饰在相关疾病中的作用以及寻找潜在药物靶点提供了新的思路。值得关注的是,Nature
Communications 同期在线发表了清华大学教授林欣课题组关于 RIPK1
调控相同结论的研究论文。

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